利用酶聯免疫吸附法（ELISA）篩選產生雜交瘤的單克隆抗體（mAb）耗時且昂貴。生物傳感和流式細胞術的結合代表了一種有前途的快速、高通量的篩選mAb克隆的方法。基于氧化石墨烯（GO）和含有硒蛋白K （SELENOK）抗原表位N-端部分的異硫氰酸熒光素（FITC）標記肽的組裝，我們設計了一種新型的氧化石墨烯熒光生物傳感器，用于篩選高親和力單抗產生的雜交瘤。FITC標記的肽被強吸附在氧化石墨烯表面，有效地淬滅了FITC熒光。特異的SELENOK mAb與FITC-肽競爭性結合，導致FITC-肽從氧化石墨烯表面釋放，熒光恢復。該傳感器成功地用于檢測SELENOK mAb，其檢測限為0.25 U。此外，我們還利用該FITC-Peptide/GO生物傳感器在單細胞水平上進行原位可視化和高通量篩選SELENOK mAb雜交瘤（SMAHs）。所提出的傳感器簡單，相對便宜，高度特異性，適用于細胞分選試驗，并且證明了在其他單抗雜交瘤庫的特異性篩選中，肽-抗體相互作用的有效使用。
流程圖1. 基于FITC-肽/GO復合物的SELENOK mAb檢測和mAb雜交瘤篩選的示意圖。
圖1. 基于FITC-肽/GO復合物檢測SELENOK mAb可行性。樣品的熒光發射光譜(A)和紫外-可見吸收光譜(B)。
圖2. 反應物濃度對檢測性能的影響。(A)在不同濃度的GO和FITC肽存在下，熒光強度發生變化。(B)FITC肽的熒光變化與GO濃度的關系。我們將添加GO后GO和FITC-肽復合物的熒光強度定義為F，然后，在存在SELENOK mAb的情況下，SELENOK/FITC-肽復合物的熒光強度定義為F1。
圖3. SELENOK mAb檢測條件的優化。測試了時間進程(A-B)、緩沖液(C-D)和pH范圍(E-F ),以確定基于熒光實驗的最佳條件。
圖4. SELENOK mAb含量的熒光檢測。(A)顯示了不同濃度的SELENOK mAb的熒光信號響應。(B)確定了熒光增強和不同濃度的SELENOK mAb之間的關系。插圖顯示了分析對較低SELENOK mAb量的響應。
圖5. SELENOK mAb的選擇性。用各種物質處理后增強的熒光強度(ΔF):甘氨酸(0.2 mM)、谷氨酰胺(1 mM)、CaCl
2 (0.5 mM)、KCl (1 mM)、葡萄糖(10 mM)、BSA (2.5 μg/mL)、FBS (2.5 μg/mL)、β-肌動蛋白 mAb(2.5 μg/mL)、SELENOK mAb(20 U)。
圖6. SMAH細胞成像。細胞成像實驗的共聚焦激光熒光圖像包括(A) SMAH細胞和(B)與28μM FITC肽孵育2小時的RPMI-8226細胞。(C) SMAH細胞用1 mM肽預處理1小時，然后與28μM FITC肽孵育另外2小時。(D) SMAH細胞和(E) RPMI-8226細胞在與28μM FITC肽孵育2小時后用GO處理10分鐘。(F)不同條件下熒光強度的流式細胞儀數據顯示類似的結果。
圖7. 篩選產生高親和力mAb的雜交瘤。(A)用于分離具有不同熒光強度的群體的分選細胞的流式細胞儀數據。(B)通過ELISA檢測的在細胞上清液中制備的SELENOK mAb的OD450值。對細胞上清液的蛋白質印跡(C)和光密度分析(D)進行了SELENOK mAb水平的分析。
相關研究成果由暨南大學生命科學技術學院生物技術系Jingru Wang等人于2024年發表在Sensors and Actuators: B. Chemical (https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.135575 )上。原文：Screening high affinity monoclonal antibody producing hybridomas using a graphene oxide-based fluorescence biosensor
轉自《石墨烯研究》公眾號
